크로이츠펠트-야콥병의 진단은 병력, 진찰 소견, 검사를 종합하여 이루어진다.

검사는 뇌파에서 특징적인 예파를 검출하고, 뇌척수액검사에서 14-3-3 단백질을 확인하며, 뇌 자기공명영상촬영(뇌 MRI)에서 특징적인 이상을 확인한다. 뇌조직 생검을 통한 조직병리학적 검사, 염기서열 분석 등도 필요하다.

뇌 MRI의 확산강조영상(DWI)이 초기 단계의 환자를 진단하는 데에 유용할 수 있다. 대뇌피질, 피질하백색질의 고강도 신호가 특징적이다.
후측 시상(thalamus)의 침범은 산발성 크로이츠펠트-야콥병에서도 발견되지만 변종 크로이츠펠트-야콥병에서 특징적이다.

산발성 크로이츠펠트-야콥병 환자의 1/3은 두개근육과 비장(spleen)에 프리온 단백질이 축적된다. 변종 크로이츠펠트-야콥병의 진단은 편도선(tonsil)이 프리온 단백질을 많이 축적하기 때문에 편도선 생검을 통해서 도움을 받을 수 있다. 그러나 뇌조직의 생검이 가장 확실한 방법이다.